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实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术服务

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详细介绍Detailed Introduction

荧光定量PCR检测

  实时荧光定量PCR原理
  实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)技术是利用荧光染料或荧光标记的特异性探针,通过实时监控PCR反应中产物变化量的荧光信号,从而实现对起始模板定量及定性的分析。
  实验用途
  1、普通基因表达水平的检测:
  能够快速准确的定量出相关基因在不同组织或生命状态下的相对表达水平。
  2、基因拷贝数的检测:
  能够准确的定量出相关基因在染色体中的拷贝数,特别适用于检测转基因植物中外源T-DNA在植物基因组中的拷贝数。
  3.特殊RNA的转录水平检测:
  根据特殊RNA的结构,如microRNA,CircRNA等,;设计其特殊引物,如颈环结构引物,反向引物等,对这类RNA的转录水平进行定量,定性分析。
  服务内容
  1.从不同样品中提取核酸(DNA或RNA);
  2.对核酸进行浓度及纯度评级;
  3.荧光定量PCR检测;
     (1)引物和探针的设计与合成;
  (2)绝对定量和相对定量的选择;
  (3)探针法和染料法的选择;
  (4)荧光定量PCR仪对目的基因的检测;
  (5)数据统计和分析(RNA浓度及质量检测报告、荧光定量PCR原始数据及优化数据、扩增曲线,溶解曲线,表达柱形图等);
  4.预实验服务:根据客户提供的目的基因序列或NCBI序列号提供客户引物和探针,并筛选出最优化的引物和探针;
  5.正式实验服务:根据预实验筛选的引物和探针对所用样品进行荧光定量PCR的检测,并对结果进行统计和分析。
  实验流程和周期
  客户在线下单—确认订单/实验材料信息—提取RNA及反转录cDNA—引物设计—加样及上机—处理分析实验数据—整理实验报告。
  优势特点
  1、高效稳定的检测出低丰度mRNA。
  2、数据处理优化,提高数据准确性。
  客户下单
  下单流程:注册成为用户,登录客户端进行下单。
  项目息填信写:
  1、客户按照页面提示填写项目名称,选择项目类型,填写个人信息及联系方式进行预提交;
  2、提交项目所需要的具体信息,包括:目标基因准确序列,基因名称、同源基因等注释信息,如果特别要求请在备注中注明。填写完毕后价格由系统自动计算生成。
  3.同一类型的样品至少要到达16个以上,则不收取常规引物合成费用,否则按照1元/bp收取常规引物合成费用。
  客户提供信息
  1.请提供新鲜材料或直接提供已纯化的DNA/RNA,确保总量>5μg/样品。如果目的基因表达量较低时,应尽量提供更高浓度的总RNA或DNA;
  2.液氮或干冰保存寄送的样品;冻存于Trizol中的样品。
  3.请提供已知的全长目标基因和参考基因序列(GeneBank Accession Number、Gene ID);
  4.请提供尽可能详细的背景资料:生物物种信息、DNA/RNA来源、丰度等,同源性等;
  5.客户可以提供引物,没有引物的情况下,本公司帮助设计合成。
  备注:microRNA,CircRNA等特殊RNA,提取加逆转录500元/样
  实验信息
  实验过程中客户可以随时登录管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时系统会通过短信自动通知客户,并发送实验报告查看地址。实验结题后,实验报告,检测结果可在线查看或打印,并永久保留。
  实验结果
  1、RNA浓度及质量检测报告;
  2、荧光定量PCR原始数据及优化数据;
  3、扩增曲线,溶解曲线;
  4、基因表达水平的柱形图。
  RNA评级办法
  (1)电泳法
  可以用于反转录的RNA质量标准为,28S和18S两条带完整,有无5S条带均可(5S条带存在的时候,就说明你提取的RNA质量非常棒),28S亮度大约是18S条带的两倍左右,无DNA污染。
  (2)微量分光光度计
  RNA质检参数OD260/OD280、OD260/OD230的意义。
  260、280、320、230nm下的吸光度分别代表了核酸、蛋白质、盐浓度和有机溶剂的值。
  230: 测定其它碳源物质,如酚,糖类等。
  A260:核酸的吸收峰测,测RNA,DNA,引物等的浓度用的。
  A280:蛋白质的吸收峰。
  一般的,我们只看OD260/OD280(Ratio,R)在1.8~2.1范围内时,我们认为 RNA中蛋白的污染是可以容忍的,不过要注意,当用 Tris 作为缓冲液检测吸光度时,R 值可能会大于 2(一般应该是<2.2的)。当R < 1.8时,溶液中蛋白的污染比较明显,可以根据自己的需要决定这份RNA 的命运。当R > 2.2时,说明RNA已经水解成单核酸了。纯RNA的OD260/OD280的比值为2.0。
  RNA质量检验
  RNA样品的品质检测一般分为总量,纯度与完整性三大项。
  总量:微量分光光度计测260nm吸收值计算。
  纯度:微量分光光度计测260nm/230nm吸收值的比值,用于评估有机溶剂残留;260nm/280nm吸收值的比值,用于评估蛋白质污染比例。

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